常用設(shè)備 
準(zhǔn)備室的設(shè)備：
單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品）、儲品柜（放置消毒過的物品）、包裝臺。配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、 PH 計(jì)（測量培養(yǎng)用液 PH 值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。
培養(yǎng)室的設(shè)備： 
液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（ -80℃ ）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實(shí)驗(yàn)記錄）。
必須放在無菌間的設(shè)備：
離心機(jī)（收集細(xì)胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、 CO2 孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機(jī)、 4℃ 冰箱（放置 serum 和培養(yǎng)用液）。
無菌操作基本技術(shù) 
無菌室的滅菌：
1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用 3‰ 來蘇爾或者新潔爾滅或者 0.5 ％過氧乙酸擦拭。
2.CO2 孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用 3‰ 新潔爾滅擦拭，然后用 75 ％酒精擦拭或者 0.5 ％過氧乙酸，再用紫外燈照射。
3.實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各 20-30 分鐘 。
4.實(shí)驗(yàn)后滅菌：用 75 ％酒精（ 3‰ 新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。
5.定期檢測下列項(xiàng)目：鋼瓶之CO2 壓力；CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)；無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300 小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。
6.水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。
實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備：
1.肥皂洗手。
2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋
3.用75 ％酒精棉球擦凈雙手。
無菌操作的演示： 
1.凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、 PBS 、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75 ％酒精擦拭瓶子的外表面
2.靠近酒精燈火焰操作。
3.器皿使用前必須過火滅菌
4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過火。
5.各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。
6.吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。
器械的清洗和消毒 
玻璃器械洗消： 
一、新的玻璃器皿的洗消： 
1.自來水刷洗，除去灰塵。
2.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5 ％稀鹽酸中 12 小時(shí)以除去臟物、鉛、砷等物。
3.刷洗、烘干： 12 小時(shí)后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g ：濃硫酸 200ml ：蒸餾水 1000ml ）浸泡12小時(shí)，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗 15 次，**后蒸餾水沖洗 3-5 次和用雙蒸水過 3 次。
5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。
6.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，當(dāng)蒸氣成直線上升時(shí)，關(guān)閉安全閥，當(dāng)指針指向 15 磅 時(shí)，維持 20-30 分鐘。
7.高壓消毒后烘干
二、舊的玻璃器皿的洗消： 
1.刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液）， 12 小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗 3 次。
3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。
4.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當(dāng)蒸氣成直線冒出 3-5 分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓表指數(shù)隨之上升，當(dāng)指針指向 15 磅 時(shí)，調(diào)節(jié)電開關(guān)維持 20-30 分鐘即可。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）
5.烘干備用：因?yàn)楦邏合竞笃髅髸?huì)被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。金屬器械洗消：金屬器皿不能泡酸，洗消時(shí)可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用 75 ％酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi) 15 磅 高壓（ 30 分鐘）消毒，再烘干備用。
橡膠和塑料： 
橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進(jìn)行如下的處理程序：
1.針式濾器帽不能泡酸液 , 用 NaOH 泡 6-12 小時(shí) , 或者煮沸 20 分鐘 , 在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時(shí)注意光面朝上 ( 凹向上 ) ，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi) 15 磅 30 分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊。
2.膠塞烘干后用 2 ％氫氧化鈉溶液煮沸 30 分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理 30 分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液 30 分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。**后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。
3.膠帽，離心管帽烘干后只能在 2 ％氫氧化鈉溶液中浸泡 6-12 小時(shí)（切記時(shí)間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液 30 分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。**后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
4.膠頭可用 75 ％酒精浸泡 5 分鐘，然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管.
6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用 70 ％酒精浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用 2—3 周時(shí)間洗除殘留的氧化乙烯。用 20000—100000rad 的 r 射線消毒塑料制品效果**好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標(biāo)記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時(shí)這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆 (CoC12·6H2o) 2g ，30％鹽酸 10m 1，蒸餾水 88m1 。
注意事項(xiàng)： 
1.嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時(shí)，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時(shí)燒干，水不能過多因?yàn)槠鋵⑹箍諝饬鲿呈茏瑁瑫?huì)降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時(shí)爆炸。
2.安裝濾膜時(shí)注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。
3.注意人體的防護(hù)和器皿的完全浸泡： A. 泡酸時(shí)要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。 B. 從酸缸內(nèi)撈取器皿時(shí)防止酸液濺到地面，會(huì)腐蝕地面。 C. 器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止 泡酸不徹底。
細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒
器材與試劑：
干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素 . 純凈水系統(tǒng)、電子天平、 PH 計(jì)、磁力攪拌器。
具體步驟：
一、水的制備： 
細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水。
二、PBS 的制備與消毒 ( 也可用于其它 BSS ，如： Hanks ， D-Hanks 液的配制 ) ：
1.溶解定容：將藥品（ NaCl 8.0g ， KCl 0.2g ， Na2HPO4·H2O 1.56g ， KH2PO40. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容** 1000ml ，搖勻即成新配制的 PBS 溶液。
2.移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將 PBS 倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi) 8 磅 消毒 20 分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。
三、胰蛋白酶溶液的配制與消毒： 
胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在 pH 為 8.0 、溫度為 37℃ 時(shí)，胰酶溶液的作用能力**強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。
1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為 0.25 ％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào) PH 到 7.2 左右）或 PBS （ D-hanks ）液中。攪拌混勻，置于 4℃ 內(nèi)過夜。
2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（ 0.22 微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于 -20℃ 保存以備使用。
四、抗生素溶液的配制
1.所用純凈水（雙蒸水）需要 15 磅 高壓 20 分鐘滅菌。
2.具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是 80 萬單位 / 瓶，用注射器加 4ml 滅菌雙蒸水。鏈霉素是 100 萬單位 / 瓶，加 5ml 滅菌雙蒸水，即每毫升各為 20 萬單位。
3.使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度**終為 100 單位 /ml 。 1 單位＝ 1 微克？
4.細(xì)胞庫之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素
5.培養(yǎng)自ATC引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。
6.培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze 通 過污染測試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。
7.寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè) flask 時(shí)，則須添加抗生素 。 (penicillin 100 units/ml +
streptomycin 100 ug/ml)
8.若要檢測mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會(huì)抑制 mycoplasma 生長。
9.去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml,
neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml
注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。
10.抗生素使用種類與濃度：
　　　　　　　　　　　工作濃度.　　　　 儲存溫度. 　　　　殺滅細(xì)菌
penicillin　　　　　　 100 units/ml 　　  -20℃ 　　　　G(+) bacteria
streptomycin 　　　　　100 ug/ml　　　　  -20℃　　　　G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline　　　 50 ug/ml 　　　　  -20℃ 　　　　G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 　　　　　　50 ug/ml 　　　　  -20℃　　　　 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma
amphotericin B 　　　　2.5 ug/ml　　　    -20℃ 　　　　yeast and molds
nystatin 　　　　　　　50 ug/ml　　　　   -20℃　　　　 yeast and molds
fungizone 　　　　　　2.5ug/ml 　　　　   -20℃　　　　　 yeast and molds
五、RPMI1640 的制備與消毒：
1.溶解、調(diào) PH 值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積 2/3 的雙蒸水中 , 并用雙蒸水沖洗包裝袋 2-3 次 ( 沖洗液一并加入培養(yǎng)基中 ), 充分?jǐn)嚢?*粉劑全部溶解 , 并按照包裝說明添加一定的藥品 . 然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各 0.5ml, 使青鏈霉素的濃度**終各為 100 單位 /ml 。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和 NaOH 調(diào) PH 到 7.2 左右。**后定容** 1000ml ，搖勻。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
2.安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。
3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。
4.分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于 4℃ 冰箱內(nèi)待用。
5.使用前要向 100ml 培養(yǎng)液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（ 4℃ 時(shí)兩周有效）。
六、血清： 
1.血清的滅火：細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在 56℃ 水浴中滅火 30 分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。
血清必須貯存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，請勿超過一個(gè)月。如果一次無法用完一 瓶，可將40～45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10 %，必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。
2.一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。
3.瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20℃ 或–70℃ **4℃冰箱溶解**，**室 溫下全溶后再分裝，一般 50 ml 無菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡 ，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由－２０ ℃ 直接 **３７ ℃ 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。
4.heat-inactivation 是指56 ℃, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement) 去活化。除非必須，一般建議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沈淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phag℃ytosis, chemotaxis and activation of lymph℃ytic and macrophage cell type。
5.勿將血清置于３７℃太久，若在３７℃ 放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。
6.血清之沉淀物
6.1 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性 及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因?yàn)闀?huì)阻塞過濾膜。
6.2 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是小黑點(diǎn) ，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在３７℃中欲培養(yǎng)此微生物“，但在37 ℃ 環(huán)境下，又會(huì)使此沈淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清之品應(yīng)立即停用，更換另一批號的血清。
七、HEPES 溶液： 
HEPES 的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（ N'-a-hydroxythylpiperazine-N'- ethanesulfanic acid ）。對細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時(shí)間控制恒定的 pH 范圍。使用終濃 度為 10-50mmol/L ，一般培養(yǎng)液內(nèi)含 20mmol/LHEPES 即可達(dá)到緩沖能力。
1mol/L HEPE 緩沖液配制方法如下：
準(zhǔn)確稱取 HEPTS 238.3g ，加入新鮮三蒸水定容** 1L 。過濾除菌，分裝后 4℃ 保存。
注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售 HEPES 為約 10g 包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi) HEPES 的終濃度仍然為 20m mol/L 。如：稱取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，過濾除菌后可完全（ 20ml ）加入 1L 培養(yǎng)液中，或者每 100ml 培養(yǎng)液中加入 2ml 即可。
八、谷氨酰胺： 
合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚**死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定， 4℃ 下放置 1 周可分解 50 ％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于 -20℃ 冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在 4℃ 冰箱中儲存 2 周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為 1 ～ 4mmol/L 。可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加** 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^濾除菌，分裝小瓶， -20℃ 保存，使用時(shí)可向 100ml 培養(yǎng)液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。
九、肝素溶液的配制： 
含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中**終濃度為 50ug/ml 。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為 0.56 克 / 瓶，配制時(shí)，可將其溶于 100ml 三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為 ℃ 。使用時(shí)，向 100ml 培養(yǎng)液中加入 1ml （精確可加入 0.9ml ）即可。
十、Ⅰ型膠原酶： 
0.1 ％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)?Ⅰ 型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入 10ml 小瓶 -20℃ 保存。#p#分頁標(biāo)題#e#
十一 、明膠溶液：#p#分頁標(biāo)題#e#
因?yàn)槊髂z難于過濾，所以配制 0.1 ％明膠溶液必須用無菌的 PBS 配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。shou要的問題是如何無菌準(zhǔn)確稱量 0.1 克 （配成 100ml 溶液） — 即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是 01. 的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入 50ml 小瓶中， 4℃ 保存。
注意事項(xiàng)： 
1.配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。
2.安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑 0.45 微米 和 0.22 微米濾膜各一張，放置位置為 0.45 的位于 0.22 微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。
3.配制 RPMI1640 培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液 PH 值**終為 7.2 ，可在配制時(shí)調(diào) PH ** 7.4 。
細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 
一、準(zhǔn)備工作
準(zhǔn)備工作對開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試，具體內(nèi)容可參閱有關(guān)文獻(xiàn)。
二、取材
在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的**培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。R
理論上講各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時(shí)，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置 4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時(shí)應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，同時(shí)也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時(shí)容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。
由組織并分離分散細(xì)胞的方法可參閱有關(guān)文獻(xiàn)。
三、培養(yǎng)
將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。
正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的 PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養(yǎng)溫度和 CO2濃度也要定時(shí)檢查。
一般原代培養(yǎng)進(jìn)入培養(yǎng)后有一段潛伏期（數(shù)小時(shí)到數(shù)十天不等），在潛伏期細(xì)胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛的分裂生長期。細(xì)胞長滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分**兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。
培養(yǎng)正在生長中的細(xì)胞是進(jìn)行各種生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的良好材料。
四、凍存及復(fù)蘇
為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度?－196℃，將細(xì)胞收集**凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，**終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無限的。
復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入 37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。
凍存過程中保護(hù)劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時(shí)溫度、融化速度等都對細(xì)胞活力有影響。
細(xì)胞原代培養(yǎng) 
一、原理
將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用 EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。 ?{uD3
二、儀器、材料及試劑
儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整** 37℃），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱（37℃）
材料：胎鼠或新生鼠
試劑：1640培養(yǎng)基（含 20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒
三、操作步驟
（一）胰酶消化法
1、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置 75%酒精泡 2—3秒鐘（時(shí)間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。
2、用 Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。
附：Hank’s液配方：5m KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加 H2O** 1000mlG1
注：Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。
3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用 Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移**小青霉素瓶中。#p#分頁標(biāo)題#e#
4、視組織塊量加入 5—6倍的 0.25%胰酶液，37℃中消化 20—40分鐘，每隔 5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。#p#分頁標(biāo)題#e#
5、加入 3—5ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。
6、靜置 5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
7、1000rpm，離心 10分鐘，棄上清液。
8、加入 Hank’s液 5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。
9、加入培養(yǎng)液 l—2 ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
10、將細(xì)胞調(diào)整到 5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移** 25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。
上述消化分離的方法是**基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步分離不同細(xì)胞。細(xì)胞分離的方法各實(shí)驗(yàn)室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質(zhì)酶等）。
（二）組織塊直接培養(yǎng)法
自上方法第 3步后，將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加**瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入 37℃靜置 3—5小時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。
四、注意事項(xiàng)
1、自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。
2、在超凈臺中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。
3、凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細(xì)菌落入。
細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法）
一、原理
細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。
傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
二、材料和試劑
1.無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)
2.trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062): 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于–20 ℃，使用前放在37 ℃ 水槽回溫。
3.新鮮培養(yǎng)基
4.無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶
三、操作步驟
（1）傳代前準(zhǔn)備：
1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。
2.用75％酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。
3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。
4.點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。
5.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。
6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。
7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細(xì)胞。
8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。
（2）胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞**好，**佳消化溫度是37℃。
2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。
3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。
（3）吹打分散細(xì)胞：
1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。
2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。
3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。
4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。
（4）分裝稀釋細(xì)胞：
1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝**2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。
2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。**后要做好標(biāo)記。
（5）繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時(shí)為一個(gè)＋，占50％為＋＋，占75％時(shí)為＋＋＋。
**不同類型細(xì)胞操作**
（1）附著型胞(adherent cell)
1.吸掉舊培養(yǎng)液。
2.用D-PBS 洗滌細(xì)胞一**二次。
3.加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 ℃ 作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA 溶 液。(若不移去trypsin-EDTA，則在 trypsin-EDTA trypsin作用后，加入適量含血清 之新鮮培養(yǎng)基終止作用，離心后再吸掉上清液。
4.輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移**新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
（2）懸浮型細(xì)胞(suspension cell)
1.吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。
2.吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移**新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
（3） 融合瘤(hybridoma)
有些 hybridoma cell需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會(huì)失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖**新培養(yǎng)瓶中。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
**傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)**
1.嚴(yán)格的無菌操作
2.適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容**1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫壁。
細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定
一、原理
培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。
計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coulter counter 粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。 血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber 中細(xì)刻9個(gè)1mm正方形再細(xì)刻16 個(gè)小格，深度均為0.1 mm。當(dāng)chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細(xì)胞數(shù)目。
在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。
存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue 染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish 。
利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力。
二、儀器、用品與試劑
0.4 % w/v 臺盼蘭trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hem℃ytometer and coverslip)
計(jì)數(shù)器(counter)
低倍倒立顯微鏡
粒子計(jì)數(shù)器(Coulter counter, Coulter Electronics)
三、操作步驟
（一）細(xì)胞計(jì)數(shù)
3.1. 取50ml 細(xì)胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等體積混合均勻于1.5ml 小離心管中。
3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計(jì)數(shù)盤chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色 ( 或紅色- Erythrosin bluish) 。
3.3. 計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(**少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，**后乘以104 ，即為每ml 中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線 上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。
3.4. 若不用血球計(jì)數(shù)盤，可用Coulter counter 作自動(dòng)計(jì)數(shù)，惟無法辨別死細(xì)胞或活細(xì) 胞。
然后按下式計(jì)算：
細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)x 2/ 4×10000
注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占 10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。
（二）細(xì)胞活力
1、將細(xì)胞懸液以 0.5ml加入試管中。
2、加入 0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色 2一 3分鐘。
3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。
4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。
死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。
活力測定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用 。
范例：
T75 monolayer culture 制成10ml 細(xì)胞懸浮液，取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之 細(xì)胞數(shù)目。
活細(xì)胞數(shù)/方格：55 ,62, 49, 59
死細(xì)胞數(shù)/方格：5, 3, 4, 6
細(xì)胞總數(shù)= 243
平均細(xì)胞數(shù)/方格= 60.75
稀釋倍數(shù)= 2
細(xì)胞數(shù)/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
細(xì)胞數(shù) /flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率：225/243﹦92.6 %
（三）MTT法測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力
活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使 MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比，也與細(xì)胞活力呈正比。
l、細(xì)胞懸液以 1000rpm離心 10分鐘，棄上清液。
2、沉淀加入 0.5－1ml MTT，吹打成懸液。
3、37℃下保溫 2小時(shí)。
4、加入 4—5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。
5、1000 rpm離心，取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計(jì) 570nm比色，酸化異丙醇調(diào)零點(diǎn)。
注意：MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞**數(shù)。
附：
1、0.4%臺盼蘭染液配制：臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水** 100 ml。Cbeqe
2、MTT配制：MTT 0.5克，溶于 100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎(chǔ)液中。4℃下保存。
3、酸化異丙醇配制：異丙醇中加入 HCl使**終達(dá) 0.04mol/L。
細(xì)胞的冷凍保存
1.注意事項(xiàng)：
1.1.欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài)，約為80 – 90 ％致密度。
1.2.冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一**二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
1.3.注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micron FGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4 ℃ 避光保存，勿作多次解凍。使用DMSO前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破華它的分子結(jié)構(gòu)，以**于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時(shí)**好戴上手套操作。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會(huì)有毒性。
1.4.冷凍保存之細(xì)胞濃度：
1.4.1.normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
1.4.2.hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些ybridoma 會(huì)因冷凍 濃度太高而在解凍24 小時(shí)后死去。
1.4.3.adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細(xì)胞種類而異。Aden℃arcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
1.4.4.other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymph℃yte須**少5 x 106 cells/ml
1.5.冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。
1.6.冷凍方法：
1.6.1.傳統(tǒng)方法： 4℃ 10分鐘--->-20℃ 30分鐘---> -80℃ 16-18小時(shí)（或隔夜）--->液氮槽vapor phase 長期儲存。
1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機(jī)以–1 ～ -3 ℃/分鐘之速度由室溫降**–120 ℃，放在液氮槽vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。
2.材料
2.1.生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞
2.2.新鮮培養(yǎng)基
2.3.DMSO (Sigma D-2650)
2.4.無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5.0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6.血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片
2.7.等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)
3.步驟：
3.1.冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。
3.2.配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，**后濃度為5-10 ％，混合均勻，置于室溫下待用。
3.3.依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
3.4.離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。
3.5.冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 ℃ 10 分鐘→ -20 ℃ 30 分鐘→ -80 ℃ 16～18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲存。
3.6.冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。程序?yàn)? program 7: HB CELL
細(xì)胞活化、細(xì)胞復(fù)蘇
1.收到細(xì)胞株包裹時(shí)， 請檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細(xì)胞株請盡速開始培養(yǎng)， 或立即冷凍保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到liq N2)。
細(xì)胞復(fù)蘇的原則－快速融化：
必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化**37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。
具體操作
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1.將水浴鍋預(yù)熱**37℃
2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。
二、取出凍存管：
1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。
2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對管外的編號。
三、迅速解凍：
1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。
四、平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3min
五、制備細(xì)胞懸液：
1.吸棄上清液。
2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。
六、細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。
七、培養(yǎng)細(xì)胞
將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。
初學(xué)者易犯錯(cuò)誤：
1.水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。
2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長。
3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。
4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。
（另：冷凍細(xì)胞解凍程序）
2.1.依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例， 制備培養(yǎng)基。jue大多數(shù)之細(xì)胞均無法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類， 若因?qū)嶒?yàn)需要， 必須有所不同時(shí)， 務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成， 確定細(xì)胞適應(yīng)后， 方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。
2.2.FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細(xì)胞而言差異極大，請務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。
2.3.將培養(yǎng)基置于 37 °C水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內(nèi)。取 出冷凍管， 立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內(nèi)。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
2.4.依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無菌操作臺內(nèi)取 10 ml培養(yǎng)基加** T25或 T75 flask中。取出已解凍 之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基， 混 合均勻，放入37 °C，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
2.5.對jue大多數(shù)細(xì)胞而言，1 % 以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會(huì)對細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除，待第二天確定細(xì)胞生長或貼附良好后再去除即可。唯對極少數(shù)因?qū)MSO 敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中,離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后， 轉(zhuǎn)移**培養(yǎng)瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。收到T25 flask 細(xì)胞時(shí)， 處理方式為︰
（1）于寄送過程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。
（2）將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫**37 °C， 并讓運(yùn)送過程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi)，依 一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中或細(xì)胞已長滿盤， 則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。